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二香苦参酊联合联苯苄唑乳膏抗甲癣菌的实验研究

时间:2020-03-05    点击: 次    来源:网络    作者:佚名 - 小 + 大

西南医科大学 四川泸州 646000

 

摘要:目的 证明二香苦参酊有抑制甲癣菌作用,且二香苦参酊联合联苯苄唑乳膏抑制甲癣菌能力比单用联苯苄唑乳膏用药作用更强。方法 分别以单用二香苦参酊、单用乙醇和空白对照做白色念珠菌抑菌效果研究,再以二香苦参酊和联苯苄唑乳膏联合、单用联苯苄唑乳膏做白色念珠菌的抑菌效果实验研究。结果 分别比较空白对照和实验组的抑菌圈大小,用方差检验和秩和检验的方法对实验数据进行分析,二香苦参酊的抑菌圈明显大于空白对照组的抑菌圈,且二香苦参酊联合联苯苄唑乳膏的抑菌圈明显大于单用联苯苄唑乳膏的抑菌圈。结论 二香苦参酊有抑制甲癣菌作用,且二香苦参酊联合联苯苄唑乳膏抑制甲癣菌能力显著强于单用联苯苄唑乳膏,可以通过进一步研究进而在临床上进行推广。

关键词:二香苦参酊;联苯苄唑乳膏;白色念珠菌;甲癣菌;抑菌圈实验

 


甲癣俗称灰指甲,引起甲癣的病原中,皮肤癣菌约占 62.8%(其中红色毛癣菌占 57. 6%、石膏样毛癣菌约占 41. 2%),酵母菌约占 31. 2%(其中白色念珠菌占 70%),非皮肤癣菌霉菌约占 6%。引起致病的念珠菌一直以白色念珠菌居首位[1],还有一些其他念珠菌种,也可引起浅部真菌感染,但致病力相对较低,因此本实验选取白色念珠菌为主要研究对象。

近年来对 187 味中药进行抗真菌作用的研究的总结工作中,发现其中

70 余味具有杀灭真菌作用,40 余味具有明显抗真菌作用,另有 40 余味抗真菌作用微弱[2]。其中黄连有效成分小檗碱已被研究证实对真菌有较强的抑制作用,特别是红色毛癣菌、威克海姆原藻和啤酒酵母[3]。藿香对皮肤癣菌的生长繁殖可以选择性地完全抑制[4]。宋军[5]等利用琼脂扩散法测定10 种皮肤癣菌在丁香酚的作用下MIC 值平均 61.25mg/L,酵母菌、酵母样菌、深部真菌 MIC 值平均为 202.50mg/L,证明丁香酚对酵母菌等也有抑制作用。桂蜀华[6]研究结果表明,苦参碱对临床常见的浅部皮肤真菌菌株有很好的抑制作用,钱利武等[7]通过小鼠模型证实大部分苦参碱具有一定程度的抗炎镇痛活性。因此本实验依据上述临床实验研究和中医药理论知识,遵从中药配伍原则选取种中药丁香 20g、藿香 12g、苦参 60g、黄连30g 配伍制成酊剂二香苦参酊。

1 材料

1.1 菌株

白色念珠菌标准菌,购自中国医药集团总公司四川抗菌素工业研究

采取抑菌圈对照实验,取 1ml 增殖后的白色念珠菌菌液与 9ml 无菌水混合,做次连续稀释,选取菌液含菌浓度在约 10^6cfu/mL 左右的菌液, 均匀稀释涂布于 10 个提前制备好的平板固体培养基:蛋白胨 3g,牛肉 0.9g,氯化钠 1.5g,琼脂 5.1g,蒸馏水 300mL,pH7.2 倒平板 15 个, 37℃恒温培养箱放置 24h 选取未污染的平板 10 取一个平板分为 3 份,分别放置含酒精和二香苦参酊以及空白的纸片(直径 6mm)。将贴好含药滤纸片的平板倒置于 37 ℃恒温培养箱内培养 24 h,通过观察抑菌圈的大小和有无初步判断二香苦参酊对测试菌是否具有杀菌效果。重复实验五次。取另一平板分为份,分别放置含联苯苄唑乳膏和乙醇的纸片和含联

苯苄唑乳膏和二香苦参酊的纸片。将贴好含药滤纸片的平板倒置于 37 ℃

恒温培养箱内培养 24 h,通过观察抑菌圈的大小初步判断联合用药的效果。重复实验五次。

2.4 统计学分析

采用 matlab r2015bf 分析处理数据,计数资料以率和百分比表示, 两样本率的比较采用配对计数资料x^2 检验,p<0.05 为有统计学意义。

3 数据分析

3.1 空白对照组

我们将空白、二香苦参酊、乙醇三组对照实验得到的抑菌圈大小数据统计如下:

1.1  空白对照组


 

所。

 

平板 1.1

平板 1.2

平板 1.3

平板 1.4

平板 1.5

1.2 药物及试剂

空白

0.600

0.600

0.600

0.600

0.600

从市场正规药店购取苦参 60g 黄连 30g 藿香 12g 丁香 20g,加 400ml

乙醇

1.198

1.137

1.035

1.303

1.408

的 95% 乙醇,浸泡 30min,然后于 80℃ 回流提取 2h,用纱布滤出滤液,

酊剂

1.040

1.020

1.224

0.927

2.000


药渣再加 400ml  95% 乙醇,同法回流提取,将两次过滤所得的滤液合并,再加热浓缩至 122ml,即为 1.0g/ml 浓度的药液。即每 100ml 药液相当于原药物 100g。选取目前国内临床治疗甲癣最常用药联苯苄唑乳膏,从市场正规药店购买。

2 方法

2.1 活化白色念珠菌

开启冻干管后,将白色念珠菌混合少许无菌水移于提前制备好的斜面培养基(蛋白胨 1g 牛肉膏 0.3g 氯化钠 0.5g 琼脂 1.7g 蒸馏水 100ml, ph7.2)置于恒温箱 37℃保存 24h,本次实验未用菌置于斜面固体培养基后于冰箱 4℃保存。

2.2 白色念珠菌培养与增殖

用接种环分别挑取斜面固体培养基上保存的白念菌待测菌落 3-5 个, 接种于 4-5ml 制备好的液体培养基中(改良沙保氏培养基:蛋白胨 1 g, 葡萄糖 2 g,加入约 80 ml 蒸馏水溶解,然后定容到 100 ml,ph7.2)置于恒温箱 37℃保存培养 20h,使真菌处于指数生长期后期。取 1mL 活化后的该菌液于另一液体培养基中,按照之前的方法,37℃孵育 20h,使真菌增殖。

2.3 抑菌实验

从数据上可以看出,酊剂对白念菌有抑菌效果,为证实结论,我们利用matlab R2015b 对表 1 所得数据进行方差检验:

1.2  空白对照组的方差检验

 

 

 

得到p=0.0036,根据统计学显著性检验方法,p<0.05 有统计学差异,


p<0.01 为有显著统计学差异,p<0.001 为有极其显著的统计学差异。故酊剂对白念菌有抑菌效果且效果较为显著。

3.2 实验组

联苯苄唑乳膏与二香苦参酊的混和剂(以下简称为混酊剂)和联苯苄唑乳膏与乙醇的混和剂(以下简称为混乙醇剂)的数据统计如下:

 

表 1.3 实验组

 

 

平板 2.1

平板 2.2

平板 2.3

平板 2.4

混酊

1.475

2.380

1.363

1.198

混乙醇

0.955

1.443

1.117

0.682

由于每个平板上的菌落数量及大小存在差异导致得到的不同平板之间抑菌圈大小差异较大,没有统计价值,所以我们不直接使用表 1.3 中得到的数据,而是取每个平板上混酊剂与混乙醇剂的差值作为统计样本,优化后的数据如下:

1.4  实验组优化

 

平板 2.1 平板 2.2 平板 2.3 平板 2.4

混酊 0.520 0.937 0.246 0.516

混乙醇 0 0 0 0

 

对混酊剂和混乙醇剂的优化后的数据进行方差检验:

1.5  实验组的方差检验

 

 

 

p=0.0081<0.01,故混酊剂相对混乙醇剂效果较为显著。

为检验实验结果是否存在偶然性,我们对混酊剂的数据进行了Wilcoxon 秩和检验,得到 p=0.0286,h=1 即实验结果显著性高,说服力强。

综上所诉,联苯苄唑乳膏与二香苦参酊混和剂的抗菌作用明显强于联苯苄唑乳膏。讨论

手足癣是一类较为常见的皮肤病,根据发病的位置分为手癣与足癣两种,主要的临床表现有水疱、糜烂、鳞屑角化及瘙痒等。若不能及时有效治疗,会对患者的正常生活造成极大困扰。因此,对手足癣患者有必要实施针对性的治疗方案。

近几十年来,国内学者对单味中药、复方中药以及中西药结合等治疗手足癣的方法进行了大量的临床实验研究,临床主要以中医辨证论治的疗效观察以及其抗真菌药物的实验室研究为主,并对比疗效确切的抗真菌外用药,取得了一定的进展。

古典医著《医宗金鉴外科心诀》对手足癣病的病机认识为“由胃经湿热下注而生”,黄连和苦参均味苦、性寒,归胃经,有清热燥湿的功效。藿香和丁香均归脾胃经,用于脾胃虚湿证,且古方中丁香就可以外用于治

疗毒肿。现代研究发现,黄连的主要有效成分小檗碱对真菌有较强的抑制作用,黄连的水煎剂和醇提取物中的小檗碱,可抑制马拉色菌和白念珠菌

[8],可能的作用机制是黄连碱与白色念珠菌的细胞壁结合,破坏细胞膜的

营养物质和排泄物,并进一步结合细胞膜和细胞核的磷脂质,导致细胞器的消失,损害细胞的结构和功能[9-11]。藿香中的广藿香油通过内外抗真菌试验证实其中的广藿香酮具有明显的抗皮肤癣菌和抗念珠菌作用,具有用于抗念珠菌外用制剂的潜力。丁香中含有的丁香酚对常见病原真茵特别是皮肤癣菌有较好的抑制和杀灭作用,且具有对皮肤无刺激性、无不良气味、毒性低的优点,作为一味中药制剂,有一定的应用价值[12]。苦参的单体成分苦参碱对临床常见的浅部皮肤真菌菌株有很好的抑制作用。汪长中等[13] 报道称苦参碱对白念珠菌的活性主要在于对其生物膜的形成有较强的抑制作用,因此影响白色念珠菌的早期黏膜黏附能力,为苦参碱在妇科、皮肤科的临床应用提供了药理学依据。在此基础上选取黄连、藿香、丁香、苦参,通过提取组成二香苦参酊,观察其对白色念珠菌的抑菌效果。

实验结果证明,中药酊剂二香苦参酊具有抗真菌活性,且联合常用抗甲癣菌西药联苯苄唑乳膏抗菌效果更强,相比单独用中药或单独用西药治疗的服药时间长、剂量大、肝肾毒性大及其他不良反应等缺点,或许可为治疗甲癣菌感染提供一种新的思路。但对于联合用药是否能真正缩短病程、提高疗效、快速止痒、降低复发率,还需要设计进一步的临床实验进行研究。

参考文献:

[1] 康克非.免疫活性细胞对白色念珠菌的反应 [ J] .中华 皮肤科杂志,

2006,39:486-487

[2] 钱方,叶秋华.二大归芷膏治疗角化型手足癣临床及实验研究[J].湖南中医药大学学报,2008;28(1):41-43.

[3] 吴嘉瑞,张冰,张光敏.黄柏药理作用研究进展[J].亚太传统医药, 20039;5(11):160-162

[4] 杨得坡,Chaumont Jean-Pierre,Millet Jolle.藿香和广藿香挥发油对皮肤癣菌和条件致病真菌的抑制作用[J].中国药学杂志,2000,35(1):9-11. [5]宋军,李鹤玉,于廉君.丁香酚抗真菌作用的实验研究[J].中国皮肤

性病学杂志,1996;10(4):203-204.

[6] 桂蜀华,付涛等.苦参碱体外抗真菌活性研究[J].中药新药与临床药理,2011;22(4):382-384.

[7] 刘梅,刘雪英,程建峰.苦参碱的药理研究进展[J].中国中药杂志, 2003;28(9):801-804.

[8] 吴嘉瑞,张冰,张光敏.黄柏药理作用研究进展[J].亚太传统医药, 20039;5(11):160-162.

[9] Iwasa K,Kamigauchi M,Ueki M,et al. Antibacterial activity and structure-activity relationships of berberine analogs[J]. Eur J Med Chem 1996,31:469.

Donlan R M,Costerton

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